用粘質(zhì)沙雷菌合成仿生離子取代和共取代羥基磷灰石納米顆粒

　　摘要

　　仿生學(xué)作為生物陶瓷的重要組成部分，以其眾多的功能優(yōu)勢而日益深入人心。天然羥基磷灰石(HA)除了主要的納米結(jié)構(gòu)外，還具有各種離子取代的特征。容易容納這些關(guān)鍵元素到HA晶格是已知的，以提高骨愈合的生物陶瓷的性能。在這項(xiàng)工作中，通過仿生方法合成的羥基磷灰石被單個(gè)和多個(gè)陽離子所取代，以獲得在骨修復(fù)中的潛在應(yīng)用。利用生長在特定生物礦化介質(zhì)中的沙雷氏菌，首次在HA上進(jìn)行了Sr、Mg和Zn的離子置換。對(duì)沙雷菌HA (SHA)中不同濃度取代離子(Sr SHA、Mg SHA和Zn SHA)的結(jié)晶度、官能團(tuán)、形態(tài)和晶體大小進(jìn)行了分析。三者均表現(xiàn)出結(jié)晶度降低，相純度降低，團(tuán)聚體大，呈針狀形貌。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)顯示碳酸鹽含量增加5.8%，與天然骨相似。此外，降低的O-H強(qiáng)度清楚地描述了HA晶格的破壞和隨后的離子取代。本研究的新穎之處在于研究了1% Sr、Zn和Mg的組合在SHA中的共取代，并建立了相關(guān)的骨參數(shù)變化。掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)圖像清楚地顯示了Sr SHA平均長度為20-50 nm，寬度為8-15 nm的均勻納米團(tuán)聚體;Zn SHA和Mg SHA均為10-40 nm長，8-10 nm寬，Sr, Zn, Mg SHA為40-70 nm長，4-10 nm寬。在個(gè)體和共取代中，沒有觀察到明顯的峰移，可能是由于濃度較低。然而，在這兩種情況下，細(xì)胞體積都增加了，因?yàn)镾r2+的存在證實(shí)了它在SHA晶格中的主導(dǎo)整合。利用能量色散x射線能譜(EDS)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)對(duì)富微量離子沉積進(jìn)行了定量分析。體外細(xì)胞毒性研究表明，NIH/3T3成纖維細(xì)胞、Mg -63骨肉瘤細(xì)胞和RAW 264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力超過90%，證明了1% Sr、Zn和Mg在SHA中的生物相容性。沙雷菌的微生物生物礦化產(chǎn)生的HA納米晶體模仿“骨狀磷灰石”，其純相、碳酸基、結(jié)晶度降低、納米團(tuán)聚、細(xì)胞參數(shù)變化、豐富的離子沉積和無毒性質(zhì)證明了這一點(diǎn)。因此，離子取代和共取代生物礦化納米SHA具有與人骨相似的特性，是解決骨損傷和促進(jìn)再生的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的合適候選材料。

　　簡介

　　透明質(zhì)酸是磷酸鈣家族中*重要的物質(zhì)之一。由于其特殊的生物相容性、高吸收和體內(nèi)緩慢的溶解速率，它在醫(yī)療行業(yè)中占據(jù)主導(dǎo)地位，應(yīng)用廣泛。雖然HA的固有元素組成類似于牙齒和骨骼的礦物成分;它們表現(xiàn)出較差的機(jī)械強(qiáng)度和疲勞性能。這是由于與納米HA相比，HA的晶粒尺寸更粗，限制了其在非承載應(yīng)用中的應(yīng)用。盡管具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和生物相容性，但低韌性和脆性的局限性導(dǎo)致了不可靠性2。目前，臨床和實(shí)驗(yàn)研究主要圍繞著開發(fā)具有仿生學(xué)特征的生物陶瓷，以克服這些限制并提高生物性能。特別是，將各種離子取代到HA的納米結(jié)構(gòu)中，以改變其生物相容性、燒結(jié)性和力學(xué)性能，反映了人們對(duì)其日益增長的興趣1。因此，生物磷灰石的獨(dú)特之處在于大量外源離子的存在，根據(jù)劑量有效地促進(jìn)骨修復(fù)。生物磷灰石與化學(xué)計(jì)量HA的不同之處在于其磷灰石晶格上普遍存在不同數(shù)量的替代離子，包括陰離子(F?、Cl?、SiO44?和CO23?)和/或陽離子取代離子(Na+、Mg2+、K+、Sr2+、Zn2+、Ba2+、Al3+)3。在此之前，純HA的斷裂韌性在0.5-1 MPa m2 /2到2.7 MPa m2 /2的范圍內(nèi)得到了提高，濃度為5 at時(shí)，濃度為0.6 wt% Mg，濃度為1.5 MPa m2 /2。%鋅。此外，這種陽離子取代增加了生物活性，表面反應(yīng)性，并顯示出良好的細(xì)胞增殖能力4。多離子取代或共取代等離子的摻雜也被報(bào)道產(chǎn)生多面屬性5,6。

　　眾所周知，HA晶格由于具有較高的結(jié)構(gòu)靈活性，可以在其晶格內(nèi)容納周期體系中近一半的元素;允許不同的替代離子取代其三個(gè)亞晶格，即Ca2+， PO43?和OH?。因此，這種結(jié)合會(huì)影響HA的物理化學(xué)和生物特性。晶體結(jié)構(gòu)、結(jié)晶度、熱穩(wěn)定性、表面電荷、溶解度、體外生物活性、體外破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞反應(yīng)性以及體內(nèi)骨再生3。二價(jià)陽離子(如Sr2+， Ba2+， Mg2+，…)和單價(jià)陽離子(如Na+， K+，…)主要替代Ca2+位點(diǎn)。這些陽離子在骨骼中的存在對(duì)骨骼的形成和再吸收有很大的貢獻(xiàn)。例如，缺乏Mg2+離子會(huì)降低成骨細(xì)胞的生長速度，導(dǎo)致骨密度降低。而Zn2+離子通過加速生長速度促進(jìn)骨形成，而Sr2+在人體內(nèi)即使大劑量也無毒，具有促進(jìn)骨形成和減少骨吸收的雙重特性6,7,8。文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)了這種離子取代HA材料的生物性能的提高9。Sr HA除了防止骨吸收和改善力學(xué)性能外，在體內(nèi)兔模型中也表現(xiàn)出更高體積的新骨形成。同樣地，Zn HA在大鼠和兔子模型體內(nèi)分別植入1個(gè)月和2個(gè)月后也表現(xiàn)出增強(qiáng)的新骨形成。在新西蘭白兔體內(nèi)試驗(yàn)中，將Mg (15 at.%)作為股骨缺損的填充物，顯示骨導(dǎo)電性增加4。

　　事實(shí)上，已知骨骼中存在的這種離子在血液中起緩沖作用，并直接影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖8。更有趣的是，一些離子(如Sr2+和Zn2+)會(huì)降低HA的結(jié)晶度，從而促進(jìn)溶解，而其他離子(如F?)則會(huì)增強(qiáng)HA的結(jié)晶度，從而減少溶解10。此外，已知Sr2+和/或Zn2+可以抵消由于高濃度Ag離子引起的任何細(xì)胞毒性11。此外，在Zn2+和Mg2+共摻雜的nHA結(jié)構(gòu)中觀察到增強(qiáng)的宿主骨愈合而沒有不良的細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)12。*近，一種由Sr2+和Mg2+(含5mol %的Sr和5mol %的Mg)納米羥基磷灰石(n-HAs)與磷酸二鈣和殼聚糖/明膠聚合物共取代的新型骨水泥顯示出異常的成骨活性，可促進(jìn)骨再生13。因此，這種離子的共取代結(jié)合了幾種可取的特性，比HA的單獨(dú)離子取代提供了有利的環(huán)境。然而，共取代離子的選擇需要仔細(xì)考慮原子取代位點(diǎn)、相穩(wěn)定性、生物影響和離子電荷平衡14。

　　本研究為了進(jìn)一步增強(qiáng)合成的HA的性質(zhì)和對(duì)稱性，首次采用仿生合成方法研究了Serratia sp.生物礦化HA的離子取代15。研究了陽離子的單獨(dú)和共取代，并對(duì)其在官能團(tuán)、結(jié)晶度、形態(tài)和生物相容性方面的能力進(jìn)行了表征。將細(xì)菌合成的HA與Sr、Zn和Mg離子組合共取代，以模擬生物磷灰石，并了解其在骨修復(fù)中的應(yīng)用優(yōu)勢。對(duì)這種離子替代的研究可能有助于更好地理解生物礦化過程，以控制沉淀相的性質(zhì)，增加生物活性和治療骨病的離子輸送16。

　　材料與方法

　　所有使用的化學(xué)試劑均為分析級(jí)。氯化鈣(CaCl2)、氯化鍶(SrCl2)、氯化鋅(ZnCl2)、氯化鎂(MgCl2)、檸檬酸三鈉、三緩沖液和甲苯從印度SRL化學(xué)品公司采購。β-甘油磷酸二鈉鹽二水合物，對(duì)硝基苯磷酸鹽(p-NPP)采購自Sigma-Aldrich(印度)。營養(yǎng)液、Dulbecco 's改良鷹鷹培養(yǎng)基(DMEM)、*低必需培養(yǎng)基(MEM)、抗生素青霉素-鏈霉素、胎牛血清(FBS)購自印度Himedia。

　　利用革蘭氏陰性沙雷菌合成HA

　　粘質(zhì)沙雷氏菌在錐形瓶中100ml營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30°C孵育15小時(shí)。3500 rpm離心15分鐘收集細(xì)胞，0.85% NaCl洗滌。將細(xì)胞懸液添加到由10mm氯化鈣、25mm β-甘油磷酸二鈉鹽二水合物、20mm檸檬酸三鈉和25mm三鈉緩沖液組成的礦化介質(zhì)中，pH調(diào)至8.517。沙雷氏菌在礦化介質(zhì)中孵育10天后，收集白色沉淀物，在100℃下干燥7 h。

　　鍶(Sr)或鋅(Zn)或鎂(Mg)取代的HA納米顆粒的合成

　　礦化介質(zhì)中的鈣離子被Sr、Zn或Mg離子取代，得到相應(yīng)的離子取代HA。確保培養(yǎng)基中離子的濃度不影響細(xì)菌培養(yǎng)條件是至關(guān)重要的。沙雷氏菌在前面“使用革蘭氏陰性沙雷氏菌合成HA”章節(jié)中所述的條件下進(jìn)行了HA的合成。將礦化介質(zhì)中的CaCl2替換為3,5和10% SrCl2，收集到的沉淀分別為3% Sr SHA, 5% Sr SHA和10% Sr SHA。同樣地，在礦化介質(zhì)中以2、4和6% ZnCl2取代CaCl2，收集到相應(yīng)的2% Zn SHA、4% Zn SHA和6% Zn SHA沉淀。同樣地，2,4和6% MgCl2取代了CaCl2。而沙雷菌僅在2% MgCl2濃度下析出HA。收集2% Mg SHA沉淀，在100°C下干燥7 h并分析。

　　共取代HA的合成

　　為了開發(fā)一種類似于骨礦物的磷灰石，進(jìn)行了離子共取代。這三種離子(Sr, Mg, Zn)在礦化介質(zhì)中被1%的SrCl2, MgCl2, ZnCl2取代，如“使用革蘭氏陰性細(xì)菌沙雷菌合成HA”部分所述，并通過沙雷菌進(jìn)一步合成HA。沙雷菌僅在培養(yǎng)基中SrCl2、MgCl2、ZnCl2濃度的1%時(shí)析出HA。收集1% Sr, Mg, Zn SHA納米顆粒粉末，在100°C下干燥7 h并分析。

　　合成的離子取代納米顆粒的表征

　　采用FTIR、XRD、SEM、TEM和ICP-OES等技術(shù)對(duì)離子取代納米顆粒和共取代納米顆粒進(jìn)行了表征。采用FTIR (Perkin-Elmer Spectrum Two, USA)在500-4000 cm?1范圍內(nèi)分析樣品的官能團(tuán)，分辨率為4 cm?1。采用Cu/Kα輻射(λ = 1.54 ?)，掃描速率為1 step/s，步長為0.10，用XRD (Bruker D8 discover powder XRD，德國)記錄了樣品的衍射圖譜。利用“UnitCell”18程序計(jì)算XRD數(shù)據(jù)得到細(xì)胞體積和細(xì)胞參數(shù)。在10 kV加速電壓下進(jìn)行金濺射后，用配有能譜儀(FEI Quanta FEG 200，荷蘭)的掃描電鏡(SEM)對(duì)樣品的表面形貌和元素組成進(jìn)行了檢測。在120 keV (Philips CM20 TEM, Netherlands)下，用透射電鏡(TEM)測定了晶體的形貌和粒徑。TEM樣品是通過將分散在乙醇中的納米顆粒滴入碳涂層的銅網(wǎng)格中制備的。使用ICP-OES Perkin Elmer Optima 5300 DV，美國對(duì)樣品中幾種離子的定量測量進(jìn)行了評(píng)估。將10-15 mg樣品粉末溶解在3 ml 1 M硝酸和27 ml蒸餾水中，并對(duì)總30 ml溶液進(jìn)行ICP-OES分析。

　　生物相容性評(píng)價(jià)

　　用MTT法測定制備的納米顆粒對(duì)NIH/3T3成纖維細(xì)胞、MG-63骨肉瘤細(xì)胞和RAW 264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性15,19,20,20。將細(xì)胞株在96孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞密度為1 × 104 /孔，與細(xì)胞培養(yǎng)基孵育24小時(shí)21。細(xì)胞單層形成后，用濃度為100 μg μL?1的納米顆粒處理細(xì)胞，孵育24 h。24 h后，取出培養(yǎng)液，PBS洗滌，然后用100 μL 0.5 mg mL?1的MTT[3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯四溴化銨]溶液替換每個(gè)孔培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育3 h，然后用200 μL DMSO(二甲基亞砜)替換MTT溶液。使用平板閱讀器(Enspire, Perkin Elmer, USA)在570nm處測量井的光密度(OD) 22。樣本中細(xì)胞活力的百分比相對(duì)于對(duì)照使用以下公式計(jì)算:

　　$$\% Cell\;viability = 100 \times \frac{OD\;of\;sample}{{OD\,of\;control}}$$

　　結(jié)果與討論

　　單獨(dú)和共取代SHA

　　研究的離子的濃度范圍是根據(jù)先前的文獻(xiàn)12,23選擇的。在Sr和Zn取代SHA的情況下，在所有三種濃度上都成功沉積。然而，只有較低濃度的2% Mg supported HA deposition by Serratia. This is in line with the well-established inhibitory effect of Mg on HA nucleation and growth24,25. Mg substitution for Ca occurs only over a limited composition and in terms of bacterial deposition 2% was the threshold. Co-substitution was possible only with 1% of SrCl2, MgCl2, ZnCl2 concentration in the mineralization media.

　　紅外光譜分析

　　三種離子取代和共取代(圖1a, b, c, d)在不同濃度下的FTIR光譜顯示了與SHA光譜相似的特征HA基團(tuán)的存在。O-P-O彎曲振動(dòng)的560,598 cm?1 (ν4)和P-O彎曲振動(dòng)的1021 cm?1 (ν3)峰的存在表明了HA對(duì)應(yīng)的磷酸基。這些結(jié)果與先前關(guān)于Sr, Zn和Mg取代的報(bào)道一致26,27。在1的情況下% Sr, Mg, Zn co-substituted SHA the most intense band of asymmetric stretching ν3, lower intensity bending modes of asymmetric ν4 doublet and faint symmetric stretching ν1 mode was witnessed, in line with prior results28.

　　此外，在1413 cm?1處的特征碳酸鹽條帶(ν3 -拉伸模式)被認(rèn)為是HA晶格中部分取代的磷酸鹽基團(tuán)。而與CO32?重疊的HPO42?在872 cm?1處的強(qiáng)波段(ν2-彎曲模式)清楚地證明了離子取代。此外，a型HA在877-880 cm?1、1500 cm?1和1540-1550 cm?1波長處的特征振動(dòng)和ab型HA在1515 cm?1波長處的特征振動(dòng)均未觀測到29。從而證實(shí)了SHA在所有離子取代中都存在b型碳酸化。由于這種b型碳酸磷灰石具有生物可吸收性、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞反應(yīng)和增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化的能力，被認(rèn)為是一種有效的骨替代材料30。CO32?的含量為5.8% in the case of co-substituted SHA and this is known to improve the bioactivity of HA owing to its resemblance with carbonated bone mineral phase.

　　用公式計(jì)算CO32 -代換率

　　$${\text{Wt}}.\% {\text{ CO}}_{{3}} = \, \left( {{28}.{62 } \times {\text{ r}}_{{{\text{c}}/{\text{p}}}} } \right) + 0.0{843}$$

　　其中r c/p是CO32?帶(1570-1330 cm?1)和PO43?帶(1230-900 cm?1)之間的面積比31,32。

　　由此可見，OH?離子從單位細(xì)胞中流失，證明Sr、Zn、Mg離子明顯取代SHA晶格。先前報(bào)道了Mg取代HA在630 cm?1和3570 cm?133處OH-振動(dòng)模式強(qiáng)度的降低。同樣，在Zn取代HA的情況下，OH -的拉伸振動(dòng)模式被報(bào)道為較低，這是由于OH -和PO43-34之間由氧產(chǎn)生的氫鍵。

　　還值得注意的是，文獻(xiàn)表明離子濃度的增加對(duì)應(yīng)于結(jié)晶度的降低。然而，在本研究中，由于所研究的濃度較低，這四種情況中的任何一種都沒有出現(xiàn)這種峰的擴(kuò)大。*后，在3374 cm-1處的寬頻帶對(duì)應(yīng)于吸附在表面的水35。

　　XRD分析

　　對(duì)比了SHA和離子取代HA粉體的XRD譜圖(圖2a, b, c和d)，在所有情況下，與HA相關(guān)的反射均與參考文獻(xiàn)JCPDS 09-0432相關(guān)?？梢奌A結(jié)晶度較低的特征峰。沒有證據(jù)表明有任何二次相，如貨幣石或刷石，因此所獲得的產(chǎn)品都是純相5。據(jù)報(bào)道，峰展寬的增加與晶體尺寸的減小直接相關(guān)。這種低分辨率的峰描述了納米尺度(≤100納米)的性質(zhì)和HA晶格內(nèi)可觀的取代水平26。此外，在獨(dú)特的HA峰沒有明顯的變化被記錄，可能是由于較低的離子濃度研究5,6。

　　關(guān)于結(jié)晶度，報(bào)告討論了離子對(duì)細(xì)胞體積和晶格參數(shù)的影響。表1描述了所有樣品的晶格參數(shù)a和c以及單位細(xì)胞的六邊形體積(圖2a, b, c和d)。鍶比HA結(jié)構(gòu)的Ca (I)更傾向于排列在“交錯(cuò)”等邊三角形頂點(diǎn)的Ca (II)位點(diǎn)。由于其較高的離子半徑大于鈣，容易容納在Ca (II)中。這種占用偏好可能是結(jié)晶度降低的原因。此外，通過將單位細(xì)胞從526.46擴(kuò)大到540.15 ?336進(jìn)行驗(yàn)證。相反，與Sr SHA相比，Zn SHA和Mg SHA顯示細(xì)胞體積減少，在2% Mg SHA的情況下為526.46至524.1 ?3，在6% Zn SHA的情況下為517.79 ?3，與先前的報(bào)道一致33。

　　此前，Matsunaga等人通過第一性原理計(jì)算建立了二價(jià)陽離子與HA的離子交換能力。離子交換能力取決于離子的大小。對(duì)于Ni2+、Mg2+、Cu2+和Zn2+等尺寸較小的陽離子，第一個(gè)*近鄰(NN)氧離子優(yōu)先于Ca (I)位。然而，在Ca (I)位點(diǎn)的大尺寸陽離子Sr2+， Pb2+， Ba2+的情況下，第一個(gè)NN氧離子被看到從Ca (I)位點(diǎn)移出它們的位置37。

　　沿著這些路線，由于Mg2+的離子半徑較小(即0.69 vs. 0.99 ?)，用Mg2+替代Ca2+使單位細(xì)胞更小，并由于晶格畸變導(dǎo)致結(jié)晶度降低。類似地，HA晶格內(nèi)較小的Zn2+離子取代Ca2+離子，導(dǎo)致單位細(xì)胞參數(shù)的收縮38。本質(zhì)上，Sr2+和Ca2+的離子半徑差小于Zn2+和Mg2+與Ca2+的離子半徑差。因此，在Sr, Zn, Mg SHA含量為1%的情況下，細(xì)胞體積增加至531.07 ?3。值得注意的是，如前所述，具有10% Sr SHA取代的Sr反映了*大的細(xì)胞體積，表現(xiàn)出其在SHA晶格中的取代優(yōu)勢，無論是單獨(dú)取代還是共取代形式。眾所周知，鎂離子會(huì)破壞HA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，促進(jìn)β-TCP(磷酸三鈣)的形成，而鍶離子能夠很容易地在HAp晶格中取代，保持單一的HAp相33。由于Sr的加入帶來了相純度和穩(wěn)定效果，從而實(shí)現(xiàn)了高效的取代平衡。

　　在晶格參數(shù)方面，“a”和“c”的變化是取代HA的理想選擇。然而，“a”和“c”的變化程度取決于取代基的類型和取代量(表1)。取代對(duì)HA晶格參數(shù)和傾斜溶解度的詳細(xì)影響已在前面說明9。在這里，細(xì)化記錄了晶格參數(shù)a和c隨著Zn取代降低到6%，這也與Li et al.34的觀察結(jié)果一致。Zn - SHA在“c”格中呈現(xiàn)不規(guī)則的趨勢。早期的報(bào)告報(bào)告了隨著鋅濃度的增加而降低的值39。然而，一些報(bào)道也將觀察到的晶格參數(shù)“c”的增加，在六方軸2b位點(diǎn)占據(jù)了一個(gè)新的位置，在這個(gè)位置上，Zn將鄰近的O4(羥基- o)原子分開，通過吸引O3(磷酸- o)原子和縮小“a”方向40或通過H2O分子簡單地取代OH-基團(tuán)而擴(kuò)大c方向并扭曲了附近的磷酸鹽四面體39。